От малярии каждый год гибнет около 600 тысяч человек. Снижение смертности примерно на 50% за последнее десятилетие стало возможным в первую очередь благодаря широкому использованию инсектицидов, однако к ним постепенно развивается устойчивость, снижающая их эффективность. Полногеномное исследование ассоциаций выявило встречающийся в природе аллельный вариант FREP1, в котором лейцин (L) заменен на глутамин (Q) — комары Anopheles gambiae с таким вариантом становились устойчивы к малярийному плазмодию Plasmodium falciparum.
Белок FREP1 (фибриноген-связанный белок 1) — ключевое «слабое звено» в цикле развития малярии. Именно с его помощью плазмодий преодолевает кишечный барьер комара — это удается единицам из тысяч проглоченных паразитов. Команда ученых из США и Бразилии с помощью CRISPR-Cas9 получила модифицированных комаров Anopheles stephensi — главных переносчиков малярии в Индии — с аллелем FREP1Q224. Эффект подтвердился: при низкой инфекционной нагрузке заражалось меньше комаров — около 80% популяции в контроле и около 30% отредактированных. Спорозоиты в слюнных железах переставали детектироваться (их обнаруживалось в среднем 4650 у обычных комаров). При высокой нагрузке медианное число ооцист упало на 41,9% (с 43 до 25), а спорозоитов стало меньше на 41,8%. При этом мутация не повлияла на размер тела, плодовитость или продолжительность жизни комаров.
В гетерозиготном состоянии мутация не давала комарам устойчивости ни к P. falciparum, ни к P. berghei.
Для распространения данного аллеля в популяции ученые сконструировали кассету с сцепленным аллельным драйвером. Она содержала систему редактирования и флуоресцентный маркер, и также гидовую РНК к гомологичной хромосоме (gRNAL224). Такая система использует гомологичную рекомбинацию, чтобы получить вариант Q224 в гомозиготе.
Сначала работу системы проверили путем контролируемого скрещивания в трех поколениях. Трансгетерозиготных комаров A. stephensi (самцов или самок) скрестили с диким типом. Анализ потомства (поколение F2) показал, что хромосомы, несущие исходный и «защитный», наследовались примерно поровну, что говорит стандартном менделевском наследовании сконструированной кассеты. Анализ показал высокую частоту редактирования мишени, унаследованной как от отца (72% случаев, или 86% от общей частоты аллеля Q224), так и от матери (86% случаев, или 93% от общей частоты аллеля Q224), когда Cas9 была получена от самок поколения F0 («бабушек»). Несколько более низкая частота конверсии (69% по отцовской линии и 50% по материнской, или 84,5% и 75% от общего числа аллелей соответственно) наблюдалась при наследовании Cas9 от «дедушек».
Ученые дополнительно проверили, может ли сцепленный аллельный драйвером поддерживать передачу FREP1Q224 на протяжении нескольких поколений при свободном спаривании комаров. Они провели три независимых эксперимента с небольшими лабораторными популяциями. Выяснилось, что доля комаров, несущих кассету, выросла с 50% в первом поколении примерно до 64% в следующем и оставалась неизменной до 10-го поколения. Также в каждом поколении ученые проводили генотипирование 50 случайно выбранных комаров и обнаружили частота аллеля FREP1Q224 быстро увеличилась с первоначальных 25% до более чем 90% за 10 поколений.
Учитывая высокий уровень окончательного внедрения аллеля FREP1Q во всех клетках, исследователи проанализировали устойчивость комаров к плазмодию. Комары 11-го поколения из предыдущих экспериментов оказались защищены от паразитов — при низкой инфекционной нагрузке интенсивность заражения снизилась с 9 до 0, 5,5 и 0 ооцист на среднюю кишку в трех подопытных популяциях. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что аллельный вариант FREP1Q может распространяться в достаточной степени, чтобы подавлять заражение паразитами в целевых популяциях комаров.
Таким образом, изменения одного нуклеотида в гене FREP1 достаточно для формирования устойчивости комаров к малярийному плазмодию и что наследование защитного аллеля FREP1Q224 можно контролировать с помощью системы сцепленного аллельного драйва. Применение стратегии можно расширить, в том числе для снижения устойчивости к инсектицидам. Также авторы заявляют, что в будущем такие аллельные драйверы можно будет сделать саморазрушающимися, спроектировав их таким образом, чтобы они снижали приспособленность, после чего исчезали из популяции. Это позволит осуществлять локальную замену аллелей без использования трансгенов.
Ослабленного плазмодия для вакцинации против малярии могут доставлять в организм укусы комаров