Динамичные взаимодействия факторов транскрипции (ФТ) с ДНК — критически важный механизм регуляции экспрессии генов и, как следствие, клеточных процессов, включая дифференциацию, рост и развитие патологий. Несмотря на широкий спектр методов изучения активности ФТ, ни один из них пока что не позволяет изучать динамические взаимодействия ФТ с ДНК в единичных клетках. В новой работе ученые из Германии и Финляндии представили протокол, призванный заполнить этот методологический пробел.
Авторы взяли за основу метод CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation): клетки инкубируют с первичными антителами, таргетирующими интересующий нас ФТ, затем — со вторичными антителами. К клеткам добавляют белок А, слитый с транспозазой Tn5, которая, в свою очередь, связана с адаптерами для NGS. Транспозаза разрезает ДНК недалеко от сайта посадки ФТ и вставляет адаптор, после чего идет этап подготовки библиотеки. Методом CUT&Tag можно анализировать единичные клетки, однако он использует высококонцентрированные солевые буферы при подготовке проб, которые не позволяют сохранить контакт ФТ с ДНК (за исключением ряда наиболее прочно связывающихся). Основное отличие нового протокола, получившего название DynaTag (Dynamic targets and Tagmentation), — это использование на этапе пробоподготовки физиологических концентраций солей в буфере (110 ммоль/л KCl, 10 ммоль/л NaCl и 1 ммоль/л MgCl2), позволяющих сохранить связь ФТ с ДНК.
Авторы протестировали протокол на зародышевых стволовых клетках мышей и сравнили его эффективность с другими схожими протоколами. DynaTag успешно картировал сайты связывания ФТ, которые не получалось выявить с помощью CUT&Tag. Эксперименты с различными методами пробоподготовки, включая другие модификации CUT&Tag, показали, что ключевую роль играют концентрации NaCl и KCl, в то время как присутствие или отсутствие в буфере MgCl2 особого влияния на результат не оказывало. Так, в буфере с концентрацией в 150 ммоль/л NaCl происходит преимущественно нецелевое связывание; при концентрации 300 ммоль/л NaCl или KCl таргетируются в основном гистоны; а физиологические концентрации позволяют выявить сайты связывания ФТ.
Чтобы продемонстрировать возможности метода, авторы изучили динамику активности ФТ на мышиной модели мелкоклеточной легочной карциномы (SCLC), развитие которой связано с мутациями в ФТ семейства p53, а также онкогенных и связанных с развитием ФТ. Одной из особенностей SCLC является ее способность вырабатывать устойчивость к химиотерапии после первых раундов лечения.
Исследователи проанализировали динамические взаимодействия ФТ в клетках рака до и после химиотерапии и обнаружили повышенный уровень связывания для факторов FOXA1 и MYC и пониженный — для ASCL1 и POU2F3. При этом изменения в динамике ФТ наблюдались в промоторах генов, экспрессия которых менялась по результатам РНК-секвенирования. Авторы отдельно отмечают повышенное связывание мутантного p53 (вариант p.R248Q) с промоторами генов, участвующих в эпителиально-мезенхимальном переходе. То есть этот процесс может быть одним из механизмов развития устойчивости к химиотерапии.
Таким образом, представленный метод позволяет оценивать изменения в динамике взаимодействий факторов транскрипции с ДНК в единичных клетках, что может способствовать дальнейшим исследованиям регуляции экспрессии генов.